液相色譜柱

液相色譜柱

液相色譜儀的系統(tǒng)由儲液器、 泵、 進(jìn)樣器、 色譜柱、 檢測器、 記錄儀等幾部分組成。 儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng) , 樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動相 , 被流動相載入色譜柱 (固定相 ) 內(nèi) , 由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù) , 在兩相中作相對運(yùn) 動時(shí) , 經(jīng)過反復(fù)多次的吸附 - 解吸的分配過程 , 各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別 , 被 分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出 , 通過檢測器時(shí) , 樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀 , 數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。

原理結(jié)構(gòu)

[1]液相色譜柱的結(jié)構(gòu):

a 、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成

柱接頭采用低死體積結(jié)構(gòu),柱接頭是兩端螺紋組件,一端是為 7/16英寸內(nèi)螺紋,另一 端是 3/16英寸的內(nèi)螺紋 (國內(nèi)外已規(guī)范化 ) 。 7/16英寸內(nèi)螺紋與 1/4英寸柱管 (Φ6.35mm) 連 接,中間放置壓環(huán)用于密封。 3/16英寸的內(nèi)螺紋與 1/16英寸 (Φ1.57mm) 的連接管連接,中 間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封。 為了盡量減少柱外死體積, 在安裝色譜柱時(shí), 用 Φ1.57mm 連接管通過空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底, 然后再擰緊空心螺釘。 壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形 后緊箍在連接管上 (連接管通過壓環(huán)后露出的管長度應(yīng)嚴(yán)格控制在 2. 5mm 長或其他固定尺 寸 ) 。

在兩端柱接頭內(nèi), 柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片 (或?yàn)V網(wǎng) ) , 用于封堵柱填料不被流動 相沖出柱外而流失。空柱各組件均為 316L 不銹鋼材質(zhì),能耐受一般的溶劑作用。但由于含 氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性, 故使用時(shí)要注意, 柱及連接管內(nèi)不能長時(shí)間存留此類溶 劑,以避免腐蝕。

b 、柱填料:

液相色譜柱的分離作用是在填料與流動相之間進(jìn)行的,柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。 正相柱:多以硅膠為柱填料。根據(jù)外型可分為無定型和球型兩種,其顆粒直徑在 3— 10 μm 的范圍內(nèi)。另一類正相填料是硅膠表面鍵合— CN , -NH2等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠。 反相柱:主要是以硅膠為基質(zhì),在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán) (ODS)的非極性填料。也有無 定型和球型之分。

常用的其他的反相填料還有鍵合 C8、 C4、 C2、苯基等,其顆粒粒徑在 3— 10 μm 之間。 填充劑的要求

常用的色譜柱填充劑為化學(xué)鍵合硅膠。 反相色譜系統(tǒng)使用非極性填充劑, 以十八烷基 硅烷鍵合硅膠為常用, 辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠 (如氰基鍵合硅烷和 氨基鍵合硅烷等)也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑, 常用的填充劑有硅膠等。 離子 交換色譜系統(tǒng)使用離子交換填充劑; 分子排阻色譜系統(tǒng)使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑; 對映異構(gòu)體的分離通常使用手性填充劑。

填充劑的性能(如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團(tuán)的表面覆蓋度、含碳量 和鍵合類型等)以及色譜柱的填充,直接影響供試品的保留行為和分離效果。孔徑在 15nm (1nm=10Å) 以下的填料適合于分析分子量小于 2000 的化合物, 分子量大于 2000 的 化合物則應(yīng)選擇孔徑在 30nm 以上的填料。除另有規(guī)定外,分析柱的填充劑粒徑一般在

1

3μm~10μm 之間。粒徑更小(約 2μm )的填充劑常用于填裝微徑柱(內(nèi)徑約 2mm ),使用 微徑柱時(shí), 輸液泵的性能、進(jìn)樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配;如有必 要, 色譜條件也需作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。 當(dāng)對其測定結(jié)果產(chǎn)生爭議時(shí), 應(yīng)以品種正文規(guī)定的色譜條 件的測定結(jié)果為準(zhǔn)。

溫度的要求

以硅膠為載體的普通鍵合固定相的使用溫度通常不超過 35℃,為改善分離效果可適當(dāng)提高 色譜柱的使用溫度,但不能超過 60℃。

流動相的要求

流動相的 pH 值應(yīng)控制在 2~8 之間。當(dāng) pH 值大于 8 時(shí),可使載體硅膠溶解;當(dāng) pH 值小 于 2 時(shí),與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落。當(dāng)色譜系統(tǒng)中需使用 pH 值大于 8 的流動 相時(shí), 應(yīng)選用耐堿的填充劑, 如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、 包覆聚合物填充劑、有機(jī) -無機(jī)雜化填充劑或非硅膠填充劑等;當(dāng)需使用 pH 值小于 2 的流 動相時(shí), 應(yīng)選用耐酸的填充劑, 如具有大體積側(cè)鏈能產(chǎn)生空間位阻保護(hù)作用的二異丙基或二 異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑,或有機(jī) -無機(jī)雜化填充劑等。

注意事項(xiàng)

色譜柱的柱效和保護(hù)柱

拿到一根新柱時(shí),一定要先看其使說明,然后測柱效,定期檢測柱效, 保留在新色譜 柱上得到的色譜圖,并記錄條件, 定期檢測儀器的譜帶展寬。 若應(yīng)用于在線監(jiān)測, 應(yīng)對 色譜柱提供在線的物理保護(hù)和化學(xué)保護(hù), 例如采取安裝在線過濾器, 自裝填料保護(hù)柱和預(yù) 裝保護(hù)柱等。在線過濾器的作用是防止顆粒在柱頭累計(jì),優(yōu)點(diǎn)是基本不影響柱效, 在需要 高柱效的時(shí)候常用, 常更換的消耗品是濾芯和墊圈保護(hù)柱的作用是防止柱子被化學(xué)污染。 缺點(diǎn)是多數(shù)保護(hù)柱影響色譜柱的柱效, 特別是在用微柱時(shí), 常用的是普通 自裝填料的保護(hù) 柱。近新出的一些保護(hù)柱例如 S e n t r y — g u a r d保護(hù)柱, 它的特點(diǎn)是高質(zhì)量、 高 效填料、 增加分析柱效、 對臟樣品載荷能力大 , 能延長保護(hù)柱的壽命,手可擰緊接 頭,安裝時(shí)不需要工具, 省時(shí)省, 可換芯式設(shè)計(jì), 能采用各種不同的填料, 主要適用于 非常臟非常復(fù)雜的樣品本底, 例如生化樣品, 環(huán)境樣品和食品等, 或者不想做太多的圃相 萃取,不想降低柱效果等情況。

色譜柱的清洗

對所做的樣品要有充分的了解,用對該樣品洗脫能力zui強(qiáng)的流動相清洗,對于硅膠柱, 先用甲醇洗去極性雜質(zhì),然后用干燥的二氯甲烷和正庚烷 1 0 0 — 2 0 O r aL依次活化, 對于鍵和相柱, 一般用甲醇一甲醇一水依次沖洗, 每種色譜柱有特定的清洗方法, 一 定要看其使用說明

色譜柱的存放

存放前除去雜質(zhì)和鹽,采用合適的存放溶劑, 避免色譜柱床的干枯,避免機(jī)械振動,防 止細(xì)菌生長,注意存放的溫度。

故障排除

1、柱壓過高

2

可能是微粒堵塞. 柱床膨脹, 不可逆吸附, 細(xì)菌生長等造成的。 也有可能是系統(tǒng)反壓問題, 例如阻尼器堵塞,進(jìn)樣器堵塞, 管路或連接口堵塞. 在線過濾器不干凈, 壓力傳感器不 準(zhǔn)確等。

2、柱效低

可能是色譜柱被污染、 過濾片部分堵塞、色譜柱內(nèi)的死體積造成,例如流動相 p H值或者 組成不合適造成固定相損失。 流動相急劇變化造成固定相物理損壞, 機(jī)械振動造成固定相 產(chǎn)生裂縫,柱床收縮或干枯。

也有可能是儀器連接的問題, 認(rèn)真檢查進(jìn)樣器、檢測器、 管路、 保護(hù)柱和在線過濾器等 是否連接好,也可能是色譜柱沒有平衡好, 進(jìn)樣量過大等問題。

3、重復(fù)性差、不出峰、回收率低

可能是色譜柱被污染, 流動相 p H 值或者組成不合適造成固定相損失 , 樣 品溶劑 不同 或樣品本身不穩(wěn)定, 固定 相極性過強(qiáng)或者流動相極性過弱. 或者發(fā)生非特異性吸附。也 可能梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)平衡時(shí)間不足,溫度波動, 流動相組成改變, 樣品溶劑不同, 樣品穩(wěn)定 性不好,方法的開發(fā)不好, 緩沖液的酸堿度不合適或者緩沖能力不足。

直到管線內(nèi)(由溶劑瓶到泵入口)無氣泡為止 , 切換通道繼續(xù) Purge ,直到所有 要用通道無氣泡為止。

10、 單擊 Pump 圖標(biāo), 出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單, 單擊 Pump Control 選項(xiàng), 選中 Off , 單擊 Ok 關(guān)泵, 關(guān)閉 Purge valve。

11、單擊 Pump 圖標(biāo),出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單,單擊 Setup pump 選項(xiàng),進(jìn)入 Pump 編輯畫面,設(shè) Flow :1.0ml/min。

12、單擊泵下面的瓶圖標(biāo),如圖所示(以二元泵為例) ,輸入溶劑的實(shí)際體積和 瓶體積。 也可輸入停泵的體積。單擊 Ok